Análisis genético y bioquímico del catabolismo del colesterol en Mycobacterium smegmatis mc²155

249 p.-72 fig.-25 tab.Los esteroides son compuestos de gran importancia en biología, medicina y química que se encuentran ampliamente distribuidos en el medio ambiente. Su estructura contiene un esqueleto de ciclopentanoperhidrofenantreno o un esqueleto derivado de éste por rotura de uno o más enlaces o contracción o expansión de los anillos (Fig. 1 A). Este esqueleto consiste en cuatro anillos fusionados, tres de seis carbonos y uno de cinco carbonos, que se nombran con las letras A-D. Este núcleo esteroideo es prácticamente plano y relativamente rígido de tal manera que los anillos fusionados no permiten la rotación en los enlaces C-C. Normalmente aparecen grupos metilo en las posiciones C-10 y C-13 y en la posición C-17 puede aparecer una cadena lateral tipo alquilo (JCBN, 1989). Los esteroles son compuestos esteroideos que poseen un grupo hidroxilo en la posición C-3 y que conservan la mayor parte del esqueleto del colestano, formado por el núcleo esteroideo y una cadena lateral de 8 átomos de carbono en el carbono 17 (Fig. 1 B). En la cadena lateral suelen presentar más átomos de carbono (JCBN, 1989). Entre los esteroles de origen natural destacan los fitosteroles en plantas, el ergosterol en hongos y levaduras, y el colesterol en células animales. Todos ellos desempeñan una importante función como agentes estabilizantes de las membranas celulares de los organismos en los que se encuentran y como precursores de una gran variedad de productos con actividades biológicas específicas.El colesterol (3-hidroxi-5,6-colesteno) (Fig. 2) es un esterol de 27 átomos de carbono en el que el grupo hidroxilo adopta una configuración β. Este alcohol policíclico ha sido una de las moléculas biológicas más estudiadas, ya que es un componente esencial de todos los tejidos animales (Bloch, 1965). El colesterol es una de las moléculas más comunes en la naturaleza, donde se encuentra formando parte de las membranas celulares de las células animales, aunque también se encuentra en algunos organismos procariotas, como se comentará más adelante. Aunque es una molécula esencial para muchos animales, incluido el ser humano, los mamíferos no requieren el colesterol en la dieta, ya que todas las células pueden sintetizarlo a partir de precursores simples. Aunque la estructura de los esteroles sugiere una ruta biosintética complicada, en los organismos eucariotas se sintetizan a partir de subunidades simples de isopreno. La síntesis de colesterol en animales tiene lugar en cuatro etapas, mostradas resumidamente en la figura 3. Esta síntesis es particularmente activa en el hígado, corteza renal, piel, intestino y en la aorta (Bloch, 1965). Dado que la cantidad total de colesterol (absorbido más sintetizado) sobrepasa la cantidad requerida por el organismo para atender al normal funcionamiento celular, parte de ese colesterol debe ser eliminado. Debido a que los mamíferos carecen de las enzimas necesarias para degradar el núcleo del colesterol, este se excreta tal cual, con pequeñas modificaciones estructurales o bien transformado en otros compuestos esteroideos (ácidos biliares u hormonas esteroideas) (Björkhem y Eggertsen, 2001). El colesterol es un compuesto popularmente conocido por los nocivos efectos que causa su excesiva concentración en nuestro organismo y por las numerosas estrategias que se han desarrollado para la prevención de dichos efectos a través de la promoción y divulgación de las dietas bajas en colesterol (Denke, 1995). Cuando la suma del colesterol sintetizado e ingerido en la dieta excede la cantidad requerida para la síntesis de membranas, sales biliares y esteroides, pueden desarrollarse acumulaciones patológicas del mismo en los vasos sanguíneos (placas arterioscleróticas) que resultan en su obstrucción (arteriosclerosis). El fallo cardíaco debido a la obstrucción de arterias coronarias es una de las principales causas de muerte en la sociedad industrializada. Por otro lado, muchos de los derivados del colesterol o de los compuestos con él relacionados poseen un gran valor como intermediarios en la síntesis de esteroles y esteroides de interés farmacológico, por lo que durante décadas la industria químico-farmacéutica les ha prestado gran atención . En conclusión, los resultados presentados en esta tesis han permitido avanzar significativamente en el conocimiento global del metabolismo aeróbico del colesterol principalmente en Mycobacterium smegmatis, aunque muchos de los hallazgos son también extrapolables a la bacteria patógena Mycobacterium tuberculosis, cuyo metabolismo del colesterol ha cobrado recientemente una gran importancia. Al mismo tiempo este trabajo ha aportado una cantidad notable de material que presenta un gran interés para el desarrollo de futuros trabajos de investigación. Así mismo, el estudio de una ruta de degradación en un microorganismo Gram-positivo es un tema pionero en nuestro laboratorio, lo que ha servido para el aprendizaje y utilización de nuevas técnicas de trabajo diferentes a las utilizadas normalmente en nuestro grupo.Peer reviewe

Mutantes recombinantes selectivos de mycobacterium smegmatis mc2 155 y su uso para la producción de 1,4-androstadien-3,17-diona o 4-androsten-3,17-diona a partir de esteroles naturales

[EN] The invention relates to bacterial strains of the species M. smegmatis with the activity 3-ketosteroid-9α-hydroxylase inactivated or with the activities 3-ketosteroid-9α-hydroxylase and 3-ketosteroid-∆1-dehydrogenase, and to the use of said strains for obtaining substantially pure AD or ADD and steroids from same.[ES] La presente invención se refiere a cepas bacterianas de la especie M. smegmatiscon la actividad 3-cetosteroide-9α-hidroxilasa inactivada o con las actividades 3- cetosteroide-9α-hidroxilasa y 3-cetosteroide-∆1-deshidrogenasa, y usos de dichas cepas para la obtención de AD o ADD sustancialmente puros así como de esteroides a partir de los mismos.Peer reviewedConsejo Superior de Investigaciones Científicas (España)A1 Solicitud de patente con informe sobre el estado de la técnic

Mutants recombinants sélectifs de mycobacterium smegmatis MC2 155 et leur utilisation pour la production de 1,4-androstadiéne-3,17-dione ou4-androsténe-3,17-dione apartir de stérols naturels

The present invention relates to bacterial strains of the species M.smegmatiswith inactivated 3-ketosteroid-9α-hydroxylase activity or with 3-ketosteroid-9α-hydroxylase and 3-ketosteroid-Δ1-dehydrogenase activities, and uses of said strains for obtaining substantially pure AD or ADD, and for obtaining steroids from samePeer reviewedConsejo Superior de Investigaciones Científicas (España)B1 Patente sin examen previ

Selective recombinant mutants of mycobacterium smegmatis mc2 155 and use thereof for producing 1,4-androstadiene-3,17-dione or 4-androstene-3,17-dione from natural sterols

The present invention relates to bacterial strains of the species M.smegmatiswith inactivated 3-ketosteroid-9α-hydroxylase activity or with 3-ketosteroid-9α-hydroxylase and 3-ketosteroid-Δ1-dehydrogenase activities, and uses of said strains for obtaining substantially pure AD or ADD, and for obtaining steroids from samePeer reviewedConsejo Superior de Investigaciones Científicas (España)A1 Solicitud de patente con informe sobre el estado de la técnic

Catabolism and biotechnological applications of cholesterol degrading bacteria

21 p.- 4 fig.-2 tab.This work was supported by grants from the Ministry of Science and Innovation (BFU2006-15214-C03-01, BFU2009-11545-C03-03),and an I3P predoctoral fellowship from the Consejo Superior de Investigaciones Científicas.Peer reviewe

Characterization of the KstR-dependent promoter of the gene for the first step of the cholesterol degradative pathway in Mycobacterium smegmatis

11 páginas, 6 figuras, 2 tablas -- PAGS nros. 2670-2680The KstR-dependent promoter of the MSMEG_5228 gene of Mycobacterium smegmatis, which encodes the 3-β-hydroxysteroid dehydrogenase (3-β HSDMS) responsible for the first step in the cholesterol degradative pathway, has been characterized. Primer extension analysis of the P5228 promoter showed that the transcription starts at the ATG codon, thus generating a leaderless mRNA lacking a 5′ untranslated region (5′UTR). Footprint analyses demonstrated experimentally that KstR specifically binds to an operator region of 31 nt containing the quasi-palindromic sequence AACTGGAACGTGTTTCAGTT, located between the −5 and −35 positions with respect to the transcription start site. This region overlaps with the −10 and −35 boxes of the P5228 promoter, suggesting that KstR represses MSMEG_5228 transcription by preventing the binding of RNA polymerase. Using a P5228–β-galactosidase fusion we have demonstrated that KstR is able to work as a repressor in a heterologous system like Escherichia coli. A 3D model of the KstR protein revealed folding typical of TetR-type regulators, with two domains, i.e. a DNA-binding N-terminal domain and a regulator-binding C-terminal domain composed of six helices with a long tunnel-shaped hydrophobic pocket that might interact with a putative highly hydrophobic inducer. The finding that similar P5228 promoter regions have been found in all mycobacterial strains examined, with the sole exception of Mycobacterium tuberculosis, provides new clues about the role of cholesterol in the pathogenicity of this micro-organismThis work was supported by grants from the Ministry of Science and Innovation (BFU2006-15214-C03-01, BFU2009-11545-C03-03) and an I3P predoctoral fellowship from the Consejo Superior de Investigaciones Científicas assigned to the project BFU2006-15214-CO3-01Peer reviewe